LAPORAN PRAKTIKUM STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI I

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Dosen Pengampu : Pujiati S.Si., M.Si

 

 

Madiun, 21 Mei 2014

Disusun Oleh :

Kelompok 5, Kelas 4A

1.    Siska Aris Pratiwi               12. 431. 001

2.    Mega Rohmi N. M.            12. 431. 004

3.    Alfian Rif’atun N.              12. 431. 006

4.    Rista Yuliasari                    12. 431. 010

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

IKIP PGRI MADIUN

2014

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

A.    JUDUL                                                    

Sterilisasi dan Pembuatan Media

B.     TANGGAL DAN WAKTU PELAKSANAAN         

Praktikum dilaksanakan pada Hari Rabu, Tanggal 21 Mei 2014, Pukul 10.10 sampai 14.30 di Laboratorium Biologi 2 IKIP PGRI Madiun.

C.    TUJUAN PENELITIAN                                  

1.      Mengenalkan kepada mahasiswa tentang konsep dan teknik sterilisasi serta prosedur yang harus dilakukan untuk keberhasilan pengkulturan.

2.      Memberi pengetahuan kepada mahasiswa mengenai berbagai jenis media pertumbuhan dan menguasai cara – cara pembuatannya.

D.    DASAR TEORI                                     

1.      Media atau Medium

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganisme lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk,1993).

Kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme tergantung
pada nutrisi yang tersedia dan lingkungan pertumbuhan yang menguntungkan. Di dalam laboratorium, persiapan gizi yang  digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme disebut  media (tunggal, sedang) (Prescott, 2002). Media dapat digolongkan berdasarkan bentuk, susunan kimianya, dan fungsinya. Berdasarkan bentuknya terdiri dari media padat, media semi padat, dan media cair. Bahan makanan yang dbutuhkan mikroorganisme dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber nitrogen (Pujiati, 2012).

Bahan – bahan untuk membuat media pertumbuhan terdiri dari beberapa bahan, antara lain :

a.       Bahan Dasar

1)      Air (H₂O) atau Aquades, sebagai pelarut.

2)      Agar, sebagai pemadat media.

b.      Nutrisi atau zat makanan

1)      Sumber karbon dan energi, yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atao anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.

2)      Sumber nitrogen, mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain.

3)      Vitamin – vitamin, yang bisa didapatkan dari berbagai tumbuhan maupun hewan seperti wortel, kentang, tauge, dan lain-lain.

(Pujiati, 2012).

c.       Bahan Tambahan

Bahan – bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, seperti garam (NaCl) yang digunakan sebagai sumber karbon dan sumber mineral bagi mikroba, gula yang digunakan sebagai sumber karbon.

2.      Sterilisasi

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam lab mikrobiologi. Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi media. Sterilisasi adalah proses untuk menjadikan alat-alat terbebas dari segala bentuk kehidupan (Pujiati, 2012).

Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa:

a.      Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170^o – 180^oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas).

b.     Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin).

c.      Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005).

3.      Uraian Bahan

a.       Kentang (Solanum tuberosum)

1)      Klasifikasi

Regum                  : Plantae

Divisio                  : Spermatophyta

Sub Divisio           : Angiospermae

Class                     : Dicotyledoneae

Sub Class              : Sympetalae

Ordo                     : Solanales

Familia                  : Solanaceae

Genus                    : Solanum

Species                  : Solanum tuberosum

Kegunaan              :Untuk ekstraknya, sebagai sumber nutrient mikroba.

2)      Morfologi

Bagian batang yang terletak dibawah permukaan tanah tumbuh daun-daun kecil seperti sisik pada ketiak daun terdapat tunas ketiak yang dapat tumbuh menjulur secara diageotropik. Buku-buku (internode) yang memanjang dan melengkung pada bagian ujungnya disebut stolon. Umbi Kentang merupakan bagian dari batang yang berfungsi sebagai tempat menyimpan cadangan makanan serta untuk berproduksi. Tanaman Kentang yang berasal dari umbi tidak terdapat akar utama tetapi hanya akar halus atau akar serabut saja yang panjangnya dapat mencapai 60 cm. Dalam tanah akar banyak terdapat pada kedalaman 20 cm (Tjitrosoepomo, 2007).

b.      Tauge (Arachis sp)

1.      Klasifikasi  

Regnum           : Plantae

Divisio             : Spermatophyta

Sub Divisio      : Angiospermae

Class                : Dicotyledoneae

Sub Class         : Sympetalae

Ordo                : Leguminales

Familia : Leguminaceae

Genus              : Arachis

Species            : Arachis sp

Kegunaan        : Untuk ekstraknya, sebagai sumber nutrient mikroba.

2.      Morfologi

Tauge merupakan kecambah yang berasal dari biji-bijian, seperti kacang hijau, yang memiliki bagian putih dengan panjang hingga tiga sentimeter. Bentuk kecambah diperolah setelah biji diproses selama beberapa hari. Bentuk tauge memang tergolong kecil dibandingkan dengan jenis sayuran lain, meskipun begitu, tumbuhan ini memiliki kandungan manfaat yang tidak kecil. Sayuran tauge jenis apapun, baik tauge kacang hijau, tauge kedelai, tauge alfafa, maupun jenis tauge lainnya mengandung banyak sekali senyawa fitokimiawi yang sangat berkhasiat. Salah satunya adalah kanavanin (canavanine), jenis asam amino bahan penyusun arginin yang paling banyak tersimpan dalam tauge alfafa (Tjitrosoepomo, 2007).

c.       Potato Dextrose Agar (PDA)

PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA cocok untuk pertumbuhan jamur. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri.

d.      Agar (Dirjen POM Edisi III, 1979)

Nama resmi           : AGAR

Nama lain              : Agar-agar

Pemerian   : Tidak berbau atau bau lemah, berasa musilago pada lidah.

Kelarutan  : Tidak larut dalam air dingin, dan larut dalam air mendidih.

Kegunaan              : Sebagai bahan pemadat medium.

Penyimpanan        : Dalam wadah tertutup baik.

Produksi                : Difco ^TM

  Bocton, Dickinson and company

  Sparks, MD 21152 USA

4.      Autoklaf

Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0 serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994). Biasanya untuk menyeterilkan media digunakan suhu 121ºC dan tekanan 15 lb/in² (SI 103,4 Kpa) selama 15 menit (Pujiati, 2012).

E.     ALAT DAN BAHAN                                        

1.      Alat

No.	Nama Alat	Fungsi	Jumlah
1.	Tabung reaksi	sebagai tempat dibuatnya media agar.	6 buah
2.	Rak tabung reaksi	untuk meletakkan tabung reaksi.	1 buah
3.	Gelas beker	Sebagai wadah untuk mencampur dan merebus ekstraksi.	2 buah
4.	Kaki 3	Sebagai peyangga gelas beker ketika dipanaskan.	1 buah
5.	Saringan	Untuk menyaring ekstraksi.	1 buah
6.	Mortal dan mortil	Untuk menghaluskan bahan – bahan untuk praktikum.
7.	Bunsen	Sebagai sumber panas.	1 buah
8.	Kompor listrik	Sebagai sumber panas.	1 buah
9.	Kapas	Sebagai penyumbat tabung reaksi dan botol infus.	-
10.	Botol infus	Sebagai wadah ekstraksi cadangan.	1 buah
11.	Pipet volume	Untuk mengukur volume ekstraksi yang akan dibuat media ang dimasukkan dalam tabung reaksi.	1 buah
12.	Pisau	Untuk memotong bahan – bahan yang diperlukan dalam praktikum.	2 buah
13.	Botol semprot	Sebagai wadah alkohol yang akan digunakan untuk sterilisasi tempat dan tangan.	1 buah
14.	Alumunium foil	Untuk melapisi tabung reaksi yang telah disumbat kapas supaya uap air saat proses sterilisasi dalam autoklaf tidak masuk dalam tabung reaksi.	-
15.	Timbangan digital	Untuk menimbang bahan – bahan yang dibutuhkan dalam praktikum.	1 buah
16.	Pengaduk	Untuk mengaduk ekstraksi selama proses pencampuran hingga perebusan supaya agar – agar tidak menggumpal.	1 buah
17.	Kertas label	Untuk melabeli paa tabung reaksi dan botol infus supaya tidak tertukar antar reaksi.	-
18.	Autoklaf	Sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi.	1 buah

2.      Bahan

No.	Nama bahan	Fungsi	Jumlah
1.	Aquades	Sebagai pelarut ekstrak. Sebagai bahan untuk menghomogenkan larutan.	1000 ml
2.	NA	Sebagai media pertumbuhan bakteri.	2,3 gr
3.	NaCl	Sebagai tambahan pelarut.	0,5 gr
4.	PDA	Sebagai media pertumbuhan kapang.	3,9 gr
5.	Gula pasir	Sebagai sumber karbohidrat, sumber karbon organik, serta sebagai sumber energi bagi mikroba.	6 gr
6.	Kentang	Sebagai sumber nutrient mikroba.	50 gr
7.	Wortel	Sebagai sumber nutrient mikroba.	50 gr
8.	Tauge	Sebagai sumber energi, bahan mineral dan sumber nitrogen bagi mikroba.	7,5 gr
9.	Daging ayam	Sebagai pembuat kaldu ayam yang akan digunakan menjadi pelarut dalam pembuatan media.	50 gr
10.	Agar bubuk	Sebagai bahan pemadat medium.	9 gr

F.     CARA KERJA                                       

1.      Pembuatan Media PDA

a.       Memasukkan media PDA 3,9 gr kedalam gelas beker yang berisi 100 ml aquades.

b.      Memanaskan campuran PDA dan aquades sampai bahan terlarut dan mendidih sambil terus diaduk.

c.       Memasukkan larutan kedalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

d.      Menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.

e.       Memasukkan tabung reaksi yang telah berisi larutan kedalam autoklaf selama ± 2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

f.       Mendinginkan media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas) hingga padat, kemudian memasukkan media kedalam lemari pendingin (kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

2.      Pembuatan Media NA

a.       Memasukkan media NA 2,3 gr kedalam gelas beker yang berisi 100 ml aquades.

b.      Memanaskan campuran NA dan Aquades sampai terlarut dan keluar gelembung pertama (jangan sampai mendidih) sambil terus diaduk.

c.       Memasukkan larutan kedalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

d.      Menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.

e.       Memasukkan tabung reaksi yang telah berisi larutan kedalam autoklaf selama ± 2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

f.       Mendinginkan media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas) hingga padat, kemudian memasukkan media kedalam lemari pendingin (kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

3.      Pembuatan Ekstrak Kentang

a.       Menghaluskan kentang yang telah dikupas sebanyak 50 gr sampai hancur.

b.      Memasukkan kentang yang telas halus kedalam gelas beker yang berisi 200 ml aquades dan merebusnya sampai mendidih.

c.       Menyaring larutan yang telah dingin sebanyak 100 ml kemudian menambahkan 3,5 gr agar – agar dan 2 gr gula pasir kedalamnya.

d.      Merebus kembali larutan sampai mendidih sambil terus diaduk.

e.       Memasukkan larutan kedalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

f.       Menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.

g.      Memasukkan tabung reaksi yang telah berisi larutan kedalam autoklaf selama ± 2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

h.      Mendinginkan media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas) hingga padat, kemudian memasukkan media kedalam lemari pendingin (kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

4.      Pembuatan Ekstrak Daging Ayam

a.       Menghaluskan daging ayam segar sebanyak 50 gr.

b.      Memasukkan daging ayam yang telah halus kedalam gelas beker yang berisi 200 ml aquades dan merebusnya sampai mendidih.

c.       Menyaring larutan yang telah dingin sebanyak 100 ml kemudian menambahkan 2 gr agar – agar dan 0,5 gr garam kedalamnya.

d.      Merebus kembali larutan sampai mendidih sambil terus diaduk.

e.       Memasukkan larutan kedalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

f.       Menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.

g.      Memasukkan tabung reaksi yang telah berisi larutan kedalam autoklaf selama ± 2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

h.      Mendinginkan media dengan posisi miring ( jangan sampai terkena kapas) hingga padat, kemudian memasukkan media kedalam lemari pendingin (kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

5.      Pembuatan Ekstrak Tauge

a.       Menghaluskan 7,5 gr tauge.

b.      Memasukkan tauge yang telah halus kedalam gelas beker yang berisi 200 ml aquades dan merebusnya sampai mendidih.

c.       Menyaring larutan yang telah dingin sebanyak 100 ml kemudian menambahkan 3 gr agar – agar dan 4 gr gula pasir kedalamnya.

d.      Merebus kembali larutan sampai mendidih sambil terus diaduk.

e.       Memasukkan larutan kedalam 6 tabung reaksi, masing - masing sebanyak 6 ml.

f.       Menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.

i.        Memasukkan tabung reaksi yang telah berisi larutan kedalam autoklaf selama ± 2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

j.        Mendinginkan media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas) hingga padat, kemudian memasukkan media kedalam lemari pendingin (kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

6.      Pembuatan Ekstrak Wortel

a.       Menghaluskan wortel sebanyak 50 gr.

b.      Memasukkan wortel yang telah halus kedalam gelas beker yang berisi 200 ml aquades dan merebusnya sampai mendidih.

c.       Menyaring larutan yang telah dingin sebanyak 100 ml kemudian menambahkan 3,5 gr agar – agar kedalamnya.

d.      Merebus kembali larutan sampai mendidih sambil terus diaduk.

e.       Memasukkan larutan kedalam tabung reaksi sebanyak 6 ml.

f.       Menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.

g.      Memasukkan tabung reaksi yang telah berisi larutan kedalam autoklaf selama ± 2 jam dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

h.      Mendinginkan media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas) hingga padat, kemudian memasukkan media kedalam lemari pendingin (kulkas) sebelum medium digunakan dalam praktikum selanjutnya.

G.    DATA HASIL PENGAMATAN                                 

Sebelum melakukan praktikum mensterilkan semua alat dan bahan dengan menyemprotkan alkohol. Sterilisasi berguna untuk mematikan mikroba yang tidak diinginkan agar tidak ikut tumbuh pada media. Pembuatan media disterilisasi menggunakan autoklaf  dengan tekanan 2 atm dan suhu 121ºC. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Pembuatan semua media dilakukan dengan pemanasan sehingga zat-zat yang terkandung dalam bahan tersebut benar-benar terekstrak, pada bahan-bahan tertentu perlu ditambahkan bahan-bahan tambahan media tauge ditambahkan gula 4 media daging agar ditambahkan NaCl, setelah semua selesai ditambah agar dan mendidih dimasukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 6ml lalu ditutup kapas sampai rapat lalu ditutup alumunium foil dan mensterilkan menggunakan autoklaf, setelah selesai media dimiringkan sampai agar mengendap. Media yang digunakan adalah wortel, tauge, kentang dan daging karena kentang mengandung banyak karbohidrat sehingga dapat digunakan sebagai sumber karbon, daging mengandung protein yang digunakan sebagai sumber nitrogen. Sedangkan wortel dan tauge mengandung banyak nutrisi sehingga digunakan sebagai sumber nutrisi. Keseluruhan sumber tersebut merupakan bahan makanan yang dibutuhkan mikroorganisme untuk tumbuh.

H.    DOKUMENTASI                                                          

1.      Proses Pembuatan Media PDA

1.      Menyiapkan dan mensterilkan alat, tempat dan tangan praktikan menggunakan alkohol.	2.      Menimbang PDA sebanyak 3,9 gr, kemudian memasukkannya dalam gelas beker yang telah berisi 100 ml aquades.	3.      Memanaskan larutan PDA hingga mendidih.
4.      Memasukkan larutan PDA yang telah mendidih kedalam 6 tabung reaksi, masing – masing 6 ml.	5.      Tabung reaksi yang telah berisi larutan PDA disumbat kapas dengan rapat dan melapisinya menggunakan alumunium foil.	6.      Mensterilkan larutan PDA atau medium dalam autoklaf selama ± 2 jam, dan suhu 121ºC.
	7.      Mendinginkan larutan PDA atau medium dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas).	8.      Medium yang telah dingin dimasukkan dalam kulkas sebelum digunakan pada praktikum selanjutnya.

2.      Pembuatan Media NA

1.      Menyiapkan dan mensterilkan alat, tempat dan tangan praktikan menggunakan alkohol.	2.      Menimbang Nutrient Agar sebanyak 2,3 gr.	3.      Mengukur aquades sebanyak 100 ml menggunakan gelas ukur dan memasukkannya kedalam gelas beker.
4.      Memasukkan nutrient agar kedalam gelas beker yang telah berisi 100 ml aquades.	5.      Memanaskan larutan NA hingga muncul gelembung pertama dan selama proses pemanasan terus diaduk supaya tidak terjadi penggumpalan.	6.      Memasukkan larutan NA yang telah mendidih kedalam 12 tabung reaksi, masing-masing 6 ml dan menyumbatnya dengan kapas dan dilapisi alumunium foil.
7.      Mensterilkan larutan NA atau medium dalam autoklaf selama ± 2 jam, dan suhu 121ºC.	8.       Mendinginkan larutan NA atau medium dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas). Kemudian menyimpannya dalam lemari pendingin.

3.      Proses Pembuatan Ekstrak Kentang

1.      Menyiapkan dan mensterilkan tempat, alat dan tangan praktikan menggunakan alkohol.	2.      Menimbang kentang yang telah dikupas sebanyak 50 gr.	3.      Menghaluskan kentang yang telah ditimbang untuk memudahkan dalam proses pemanasan.
4.      Memasukkan kentang yang telah halus kedalam gelas beker yang berisi 200 ml aquades dan memanaskannya hingga mendidih.	5.      Menyaring larutan kentang yang telah mendidih dan mengambilnya sebanyak 100 ml.	6.      Menimbang 2 gr bubuk agar dan menambahkannya kedalam 100 ml larutan kentang yang telah disaring.
7.      Memanaskan kembali larutan yang ditambahkan bubuk agar hingga mendidih dan mengaduknya secara kontinu.	8.      Memasukkan larutan yang telah mendidih kedalam 6 tabung reaksi, masing-masing 6 ml.	9.      Menyumbat tabung reaksi menggunakan kapas hingga rapat dan melapisinya dengan alumunium foil.
10.  Memasukkan sisa larutan kedalam botol infus untuk dijadikan medium cadangan.	11.  Mensterilkan larutan kentang atau medium dalam autoklaf selama ± 2 jam, dan suhu 121ºC.	12.  Mendinginkan larutan kentang atau medium dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas). Kemudian menyimpannya dalam lemari pendingin.

4.      Proses Pembuatan Media Daging Ayam

1.      Menyiapkan dan mensterilkan alat, tempat dan tangan praktikan menggunakan alkohol.	2.      Menimbang daging ayam tanpa lemak sebanyak 50 gr.	3.      Menghaluskan 50 gr daging menggunakan mortal dan mortil.
4.      Memanaskan daging yang telah halus dengan 200 ml aquades menggunakan gelas beker hingga mendidih.	5.      Menyaring larutan yang telah mendidih dan mengambilnya sebanyak 100 ml.	6.      Menimbang bubuk agar sebanyak 2 gr dan NaCl sebanyak 0,5 gr, kemudian memasukkannya kedalam 100 ml larutan yang telah disaring.
7.      Memanaskan kembali larutan hingga mendidih sambil terus diaduk.	8.      Memasukkan larutan yang telah menddih kedalam 6 tabung reaksi, masin-masing 6 ml dan sisanya dimasukkan kedalam botol infus.	9.      Menyumbat tabung reaksi dan botol infus menggunakan kapas dengan rapat dan melapisinya menggunakan alumunium foil.
10.  Mensterilkan larutan kentang atau medium dalam autoklaf selama ± 2 jam, dan suhu 121ºC.	11.  Mendinginkan larutan daging ayam atau media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas). Kemudian menyimpannya dalam lemari pendingin.

5.      Proses Pembuatan Media Tauge Agar

1.      Menyiapkan dan mensterilkan alat, tempat dan tangan praktikan menggunakan alkohol.	2.      Menimbang tauge sebanyak 7,5 gr.	3.      Menghaluskan tauge menggunakan mortal dan mortil.
4. Mencampurkan tauge yang sudah dihaluskan ke dalam gelas beker yang telah berisi 200 ml aquades.	5. Memanaskan campuran tauge dan aquades hingga mendidih.	6. Menyaring ekstrak tauge dan mengambil bagian yang jernih sebanyak 100 ml.
7. Menimbang gula sebanyak 4 gr dan agar sebanyak 3 gr.	8. Memasukkan gula dan agar yang telah ditimbang kedalam 100 ml larutan jernih.	9. Memanaskan kembali larutan hingga keluar gelembung pertama sambil mengaduknya secar kontinu.
10. Memasukkan larutan yang telah mendidih kedalam 6 tabung reaksi masing-masing sebanyak 6 ml, kemudian menyumbat tabung reaksi dengan kapas dan melapisinya menggunakan alumunium foil.	11. Mensterilkan larutan kentang atau medium dalam autoklaf selama ± 2 jam, dan suhu 121ºC.	12.  Mendinginkan larutan tauge atau media dengan posisi miring (jangan sampai terkena kapas). Kemudian menyimpannya dalam lemari pendingin.

6.      Proses Pembuatan Media Ekstrak Wortel

1. menyiapkan dan mensterilkan alat, tempat dan tangan praktikan menggunakan alkohol.	2. menimbang wortel yang telah dikupas sebanyak 50 gr.	3. menghaluskan wortel menggunakan mortal dan mortil.
4. memanaskan wortel yang telah halus dengan aquades 200 ml hingga mendidih.	5. menyaring ekstrak wortel dan mengambilnya sebanyak 100 ml.	6. menimbang agar bubuk sebanyak 2 gr.
7. merebus kembali ekstrak wortel dan menambahkan bubuk agar sambil mengaduknya secara kontinu.	8. Memasukkan ekstrak kedalam tabung reaksi, masing – masing sebanyak 6 ml. Kemudian menyumbat tabung menggunakan kapas dan melapisinya dengan alumunium foil.	9. mensterilkan media menggunakan autoklaf, dengan suhu 121oC, dan tekanan 2 atm selama ±2 jam.
	10. mendinginkan larutan PDA atau medium dengan posisi miring. Kemudian medium yang telah dingin dimasukkan dalam kulkas sebelum digunakan pada praktikum selanjutnya.

I.   PEMBAHASAN                         

Steril merupakan syarat utama dalam praktikum, apalagi dalam praktikum mikrobiologi. Sterilisasi dapat dilakukan dengan banyak cara, diantaranya dapat secara langsung menggunakan alkohol yang disemprotkan ke alat, tempat dan tangan praktikan sebelum melakukan praktikum. Alkohol sebagai disinfektan dengan cara melarutkan lipid pada membran sel mikroorganisme dan mendenaturasi protein yang dimiliki oleh mikroorganisme tersebut (Pratiwi, 2008). Meskipun mampu mensterilkan alat – alat dan bahan, alkohol tidak cocok digunakan pada kulit sebab alkohol hanya membunuh sel vegetatif mikroorganisme diatas permukaan kulit tetapi tidak membunuh endospora, sel resisten atau sel yang lebih dalam yang berada di pori – pori kulit. Alkohol hanya mampu menghambat mikroba tetapi tidak dapat mensterilkan kulit (Dwijoseputro, 2003). Selain itu dapat juga dilakukan dengan uap air panas beertekanan, yakni sterilisasi menggunakan auotklaf. Autoklaf merupakan alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121ºC (Pujiati, 2012).

Praktikum mikrobiologi kali ini, kami menggunakan dua cara tersebut untuk proses sterilisasi. Untuk penggunaan autoklaf, autoklaf terlebih dahulu dipanaskan selama 15 menit, kemudian tabung reaksi yang berisi media pertumbuhan mikroba atau larutan agar dimasukkan kedalam autoklaf hingga mencapai suhu  ±121º C atau sekitar ±2 jam. Cara ini merupakan cara yang biasa digunakan dalam beberapa praktikum mikrobiologi pada saat sterilisasi.

Pembuatan media pertumbuhan mikroba pada praktikum kali ini tidak hanya menggunakan aquades dan nutrient agar saja, tetapi ada beberapa media dengan tambahan ekstrak tertentu dan proses pembuatannya terbagi menjadi beberapa kelompok, yakni;

1.      Kelompok Pembuatan Media NA

Kelompok ini membuat media pertumbuhan dengan hanya menggunakan campuran aquades dan `natrium agar. Tingkat keberhasilan pembuatan media ini sangatlah tinggi, karena apabila dibandingkan dengan media yang ada penambahan ekstrak lain, media ini lebih mudah dalam pembuatannya. Tetapi, ternyata ada juga yang tidak berhasil dalam pembuatan media ini, hal ini kemungkinan disebabkan kurangnya ketelitian dalam praktikum dan tergesa – gesa.

2.      Kelompok Pembuatan Media PDA

Kelompok ini membuat media pertumbuhan mikroba menggunakan Potato Dextrose Agar (PDA) yang berguna untuk menumbuhkan atau mengidentifikasikan yeast atau kapang. Bahan yang digunakan hanyalah aquades dan bubuk PDA. PDA sendiri sudah ada dalam bentuk instantnya (dalam bentuk bubuk) sehingga tidak perlu membuatnya terlebih dahulu.  

3.      Kelompok Pembuatan Media Ekstrak Kentang

Kelompok ini menggunakan tambahan ekstrak kentang dalam pembuatan media pertumbuhan mikroba. Kentang yang mengandung banyak karbohidrat berguna sebagai sumber karbon yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba. Kelompok ini mencampurkan larutan ekstrak kentang dengan bubuk agar serta gula pasir dalam pembuatan media. Dalam pembuatan media ektrak kentang ini diperlukan penyaringan, untuk mendapatkan larutan yang jernih tanpa tercampur dengan daging kentang masih kasar sehingga tidak mempengaruhi petumbuhan mikroba yang nantinya akan ditumbuhkan pada media ini.

4.      Kelompok Pembuatan Media Kaldu Daging Ayam

Membuat media pertumbuhan mikroba kaldu ayam ini menggunakan daging ayam tanpa lemak untuk membuat kaldunya, selain kaldu daging ayam dan agar, juga ditambahkan NaCl (garam) dalam pembuatannya yang  berguna sebagai sumber karbon dan sumber mineral bagi mikroba.

5.      Kelompok Pembuatan Media Ekstrak Tauge

Kelompok ini menggunakan ekstrak tauge sebagai pelarut bubuk agar. Tauge sendiri mengandung bahan yang berguna sebagai sumber nutrient bagi mikroba, sehingga cocok untuk bahan pembuatan media pertumbuhan mikroba. Selain itu, juga ditambahkan gula pasir dalam campuran larutan ekstrak tauge dengan agar yang berguna sebagai sumber karbon.

6.      Kelompok Pembuatan Media Ekstrak Wortel

Kelompok terakhir ini, menggunakan ekstrak wortel sebagai pelarut bubuk agar. Selain larutan ekstrak wortel dan bubuk agar tidak ada tambahan bahan lain seperti halnya dalam pembuatan media ekstrak kentang dan ekstrak tauge yang ditambahkan gula pasir, serta media kaldu daging ayam yang ditambahkan garam. Tetapi dalam praktikum kali ini, ada sedikit kesalahan atau kurang ketelitian dari paktikan, yakni saat proses penyaringan, saringan yang digunakan memiliki pori atau lubang kurang kecil sehingga masih ada sebagian ampas wortel yang tercampur dalam media yang dipadatkan dan nantinya akan berpengaruh terhadap hasil pertumbuhan mikroba yang ditumbuhkan dalam media ini.

Keseluruhan proses pembuatan media dalam praktikum ini, dilakukan pemanasan sebanyak 2 kali, pertama pemanasan untuk membuat ekstrak dan yang kedua adalah pemanasan untuk mencampurkan pelarut yang berupa ekstrak hasil dari pemanasan pertama dengan bubuk agar dan bahan tambahan lainnya. Tetapi untuk media NA dan PDA hanya memerlukan 1 kali perebusan karena pelarut yang digunakan adalah aquades. Selain itu seluruh media menggunakan bahan agar, yang menjadi pemadat medium, selama proses pemanasan yang telah ditambahkan bubuk agar larutan harus selalu diaduk supaya tidak terjadi penggunpalan pada larutan.   

Bahan, alat maupun praktikan haruslah benar – benar steril, terutama kesterilan tabung reaksi, karena tabung reaksi akan menjadi tempat dibuatnya media untuk pertumbuhan mikroba. Dengan begitu tabung reaksi yang masing kosong sebelumnya disterilkan terlebih dahulu menggunakan alkohol, kemudian tabung reaksi yang masih kosong disumbat menggunakan kapas hingga benar – benar rapat (terdengar bunyi “puk” saat kapas dilepas) dan kapas hanya dilepaskan saat akan memasukkan media yang akan dipadatkan dan langsung menutupnya kembali untuk menghindarkan terkontaminasinya media dari mikroba yang banyak terdapat di alam bebas. Sebelum tabung reaksi yang telah diumbat menggunakan kapan tersebut disterilkan dalam autoklaf, terlebih dahulu bagian mult tabung reaksi dilapisi menggunakan alumunium foil dengan tujuan supaya uap air saat proses sterilisasi tidak masuk kedalam tabung reaksi yang telah berisi media dan mengkontaminasinya.

Proses sterilisasi terakhir dari praktikum pembuatan media ini adalah mensterilkan media yang sudah berada dalam tabung reaksi menggunakan autoklaf dengan suhu 121ºC dan tekanan 2 atm atau sekitar ±2 jam. Setelah proses sterilisasi dalam autoklaf selesai media didinginkan dengan posisi miring tetapi jangan sampai terkena kapas penyumbang tabung reaksi supaya tidak terkontaminasi hingga media menjadi padat. Setelah, media menjadi padat kemudian media dimasukkan dalam lemari pendingin (kulkas) sebelum digunakan dalam praktikum selanjutnya supaya media tidak rusak.   

J. KESIMPULAN

Praktikum pembuatan media pertumbuhan mikroba, steril merupakan hal yang penting, karena steril menjadi faktor berhasil tidaknya praktikum. Sterilisasi dapat dilakukan dengan banyak cara diantaranya yakni menggunakan alkohol sebagai penyeteril alat, bahan dan penghambat pertumbuhan mikroba bagi praktikan serta menggunakan autoklaf sebagai penyeteril medium.

Pembuatan media pertumbuhan mikroba dapat dilakukan dengan berbagai bahan tambahan selain aquades dan bubuk agar saja, bubuk agar hanya berguna sebagai pemadat medium, bukan sebagai media utama untuk pertumbuhan mikroba. Dari praktikum ini diketahui pula bahwa berbeda pelarut maupun bahan pembuatan media, berbeda pula perlakuan ataupun tambahan bahan lain yang diperlukan.

DAFTAR PUSTAKA

Atlas, Ronald. 2005. Handbook of Media for Environmental Microbiology Second Edition. USA: Taylor & Francis Group.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Presscott, Harley. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology Fifth Edition. The McGraw-Hill Companies.

Pujiati. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Madiun: Ikip PGRI Madiun Press.

Tjitrosoepomo.G.2007. Taksonomi Tumbuhan Obat-Obatan. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Jakarta: Erlangga.